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 環(huán)酰苷放免試劑盒操作說明書

CAMP RIA KIT

一、藥物供應(yīng)試驗(yàn)

     1.BSA 1瓶（用于配制0.2%BSA的醋酸緩沖液）：溶于 15  毫升50mM PH 4.75

的醋酸緩沖液（配法見后）

2.乙酰化劑試劑：使用前將三乙胺和醋酐混勻即可(三乙胺和醋酐各一瓶)

3.¹²⁵I- CAMP1瓶：使用時用50 mM醋酸緩沖液 10 毫升稀釋標(biāo)記品（約2萬CPM左右/0.1ml）.

4. CAMP標(biāo)準(zhǔn)1瓶：取 100  微升，用 2.6  毫升50 mM醋酸緩沖液稀釋為2pmol/0.1ml，然后倍比稀釋成8個濃度點(diǎn)：1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.008pmol/0.1ml

(B1～B8)。

5. CAMP抗血清一瓶：使用時用含0.2%BSA的醋酸緩沖液13 毫升溶解

6.羊抗兔IgG血清1瓶，每瓶用 10 ml生理鹽水溶解即可，4℃保存。

7.正常兔血清1ml，用 10 ml生理鹽水溶解即可4℃保存。

8、EDTA抗凝劑1瓶。

9、醋酸緩沖液1瓶： 1：4稀釋（1份該液加3份蒸餾水）。

二、操   作

                          CAMP  RIA 加液程序    （單位： ul ）

           ————————————————————————————

              試   劑      T     NSB      B₀     S₁~S8      樣  品

           ————————————————————————————

              醋醋緩沖液  ——    200      100     ——      ——

              標(biāo) 準(zhǔn) 品    ——    ——    ——     100       ——

              樣        品    ——    ——    ——    ——       100

              乙酰化試劑  ——      5          5       5         5

              抗  血  清    ——    ——     100     100       100

             ¹²⁵I-CAMP  100     100      100     100       100

           ————————————————————————————

                                  充分混勻，4℃   過夜。

           ————————————————————————————

              正常兔血清   100     100      100     100      100

              羊抗兔IgG    100     100      100     100      100

              ————————————————————————————

                                  充分混勻，4℃   過夜。

              ————————————————————————————

  搖勻，室溫放置2～3h, 3000rpm離心15分鐘，吸去上清，在γ計(jì)數(shù)器上測定沉淀CPM數(shù)。

三、計(jì)算

      NSB為非特異結(jié)合管，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本測得值均需減去NSB值，以B/B0計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測樣品結(jié)合百分率，在半對數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值。或由γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制得程序，直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。或從EXEL表格中的直線回歸方法計(jì)算。所得結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即可。

四、樣品收集

1、需配試劑

1）  EDTA抗凝劑。取9.3克EDTA二鈉鹽加入1mol/L   NaOH溶液25ml，溶解后加水到50ml.。

2）  50mMPH4.75醋酸緩沖液，（含4mM EDTA）：取27.22克NaAc . 3H₂0溶于1000ml蒸餾水，即為0.2M  NaAc，用冰醋酸配制0.2M醋酸，然后取410毫升0.2M HAC和590毫升0.2M NaAc混勻，測PH值調(diào)到PH 4.75，然后每1000毫升溶液加入5.95克 EDTA 二鈉鹽溶解即可.此溶液為200 Mm  pH 4.75 的醋酸緩沖液，EDTA為16mM。使用時將該液1：4稀釋。（1份該液加3份蒸餾水）即成50mM  pH4.75醋酸緩沖液，含EDTA 4Mm.

2、血樣本處理

1）  取靜脈血1～2ml，注入含DETA抗凝劑50ul的試管中，搖勻，一小時內(nèi)離心4℃，2000rpm離心10min，分離血漿， —20℃保存，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

2）  血漿處理：取0.1ml血漿加入2ml無水乙醇，振搖1分鐘，靜置5分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液到入指形管或青mei素小瓶，殘?jiān)偌尤?5%乙醇1ml，勻漿，3000rpm離心10分鐘。合并上清液，于60℃烤箱中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。測量時用1ml醋酸緩沖液溶解，然后取0.1ml測量，此時稀釋倍數(shù)為100。結(jié)果×100即為pmol/ml.

3、組織樣品處理

取組織50毫克左右放入盛有2ml冷的50mM  PH4.75醋酸緩沖液的試管內(nèi)(冰浴)，勻漿，加入2ml無水乙醇，混勻，靜止5分鐘，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘，將上清液收集在青mei素小瓶內(nèi)，再用75%乙醇2ml洗沉淀，勻漿分散，混勻，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘。合并上清液,60℃烤箱中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。測量時用1ml醋酸緩沖液溶解，然后取0.1ml測量。

  4、對于血、組織樣本，不同血樣或組織中的CAMP或CGMP含量不同，測試前預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣品稀釋度。

五、正常人血漿參考值：

CAMP:23.1±7.7pmol/ml

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