無需參考的甲基化分析新方法
分析DNA甲基化的高通量方法大多依賴參考基因組，而許多物種不一定有。zui近，奧地利的研究人員就開發出一種方法，在沒有參考基因組的情況下分析DNA甲基化。這項成果于本周發表在《Cell Reports》上。
文章的*作者是奧地利CeMM分子醫學研究中心的Johanna Klughammer。她及其同事將簡化甲基化測序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）與一種名為RefFreeDMA的應用程序相結合。這種程序能從RRBS讀取中推斷出基因組，并發現樣品中差異甲基化的區域。
她們開發的這個流程依賴于脊椎動物中DNA甲基化的非隨機分布，大多數甲基化都位于CpG位點。在她們這個方法中，DNA先通過限制性內切酶Mspl和/或Taql消化，這兩種酶分別切割C^CGG和T^CGA，并且對甲基化不敏感。之后，這些消化后的序列被用來創建RRBS測序文庫。
無需參考的甲基化分析新方法
研究人員指出，他們利用九個物種（人、小鼠、大鼠、牛、狗、雞、鯉魚、鱸魚和斑馬魚），驗證和優化了96孔RRBS方法的基因組覆蓋度和樣品通量，將所覆蓋的CpG位點數量從250萬個提高到400萬個。
RefFreeDMA是一個基于Linux的軟件流水線，利用了RRBS讀取的特點，如明確的起始和中止點。通過匯集特定物種中所有樣品的RRBS讀取，這個應用程序推斷出每個集群的一致序列。在胞嘧啶和胸腺嘧啶同時存在的情況下，研究人員指出，胞嘧啶被保留，因為這可能反映了甲基化的胞嘧啶。
一旦生成了推導的基因組，研究人員便利用BSMAP/RRBSMPA將讀取與一種自定義的DNA甲基化檢出腳本相比對，以評估每個CpG位點的甲基化部分。隨后，研究人員將差異甲基化的讀取進行排序。那些排名靠前的讀取被導出為FASTA/FASTQ文件，通過已注釋的相關基因組來進行生物學解釋。
為了驗證這種方法，Klughammer及其同事將其應用在三個物種（人、牛和鯉魚）的44個樣品中，并比較了無參考和有參考的分析。他們發現，對于兩種方法，CpG位點的平均DNA甲基化水平在很大程度上是相似的。同時，推導的基因組也大體反映了參考基因組。
例如，1,522,786個推導基因組片段中的1,254,324個可比對到人類基因組。
“我們對代表性染色體的比對位置進行作圖時，發現這兩種方法有著很好的一致性，而對于所有樣品和所有物種，這兩種方法所獲得的DNA甲基化值也高度一致，”Klughammer及其同事在文中寫道。
研究人員指出，這種方法不僅能夠應用于野生種群，也能夠應用于農業和水產養殖的樣品。
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