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 Western及IP細胞裂解液使用操作指南

Western及IP細胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來裂解細胞，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質可以用于PAGE電泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X-100， 低濃度sodium pyrophosphate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

操作說明：（僅供參考）

對于培養細胞樣品：

1. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 對于貼壁細胞：去除營養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。 對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必須分裝成50-100萬細胞/管，然后在裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

4. 裂解液使用量說明：通常6孔板每孔細胞加入100μL裂解液已經足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到150μL或200μL。每100萬細胞用100μL本產品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細胞有所不同。

對于組織樣品：

1. 把組織剪切成細小的碎片。

2. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20mg組織加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態的不同組織有所不同。

6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex是樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續試驗。直接裂解的優點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注意事項：

1.為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融?？梢赃m當分裝后使用。

2.裂解樣品的所有步驟都需要在冰上或4℃進行。

3.本產品僅供科研實驗用，不做其它用途。

4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。